[1]顿国栋,童亚楠,卢晓雪,等. 粪便具核梭杆菌的免疫磁珠捕获联合实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价[J].免疫学杂志,2019,(09):811.
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 粪便具核梭杆菌的免疫磁珠捕获联合实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价()
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《免疫学杂志》[ISSN:1000-8861/CN:51-1332/R]

卷:
期数:
2019年09期
页码:
811
栏目:
技术与方法
出版日期:
2019-09-01

文章信息/Info

作者:
 顿国栋童亚楠卢晓雪
关键词:
 具核梭杆菌结直肠癌免疫磁珠qPCR
文献标志码:
A
摘要:
 目的 建立定量检测粪便中具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F. nucleatum)的免疫磁珠捕获联合实时荧光定量 PCR(IMBs-qPCR)技术方法。方法 5×108 CFU F. nucleatum(0.4%甲醛灭活)免疫新西兰兔制备多克隆抗体,饱和硫酸铵沉淀法和Hi Trap Protein G HP亲和层析法纯化抗体;优化 MS 300免疫磁珠偶联多克隆抗体和捕获F. nucleatum的反应条件。根据F. nucleatum特异性基因NusG设计引物和构建含目的基因的载体质粒,建立 qPCR 反应体系并绘制 qPCR 标准曲线。最后,在不同浓度(50 CFU/200 mg~105 CFU/200 mg)F. nucleatum的人粪便标本中,评价该方法的检测效能。结果 成功制备F. nucleatum多克隆抗体,抗体ELISA 效价>320 000,盐析和亲和层析纯化抗体纯度分别为 60%和 85%;多克隆抗体偶联免疫磁珠时偶联缓冲液最佳 pH 值为 5.0,最佳温度为 25 ℃,最佳偶联时间为 2.5 h,加入抗体最适量为 10 μg/mg,免疫磁珠最佳捕获温度为 37 ℃,时间为 40 min;成功建立 qPCR 反应体系;IMBs-qPCR 和粪便全基因组 DNA 提取法直接检测模拟粪便标本最低检测限分别为 100 CFU/200 mg和 400 CFU/200 mg,ROC 曲线中AUC分别为 0.948和 0.878。结论 成功建立了IMBs-qPCR 检测粪便中F. nucleatum的方法,该方法具有简便快速、灵敏度高、特异性好等特点。

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更新日期/Last Update: 2019-09-02